Веткорм. - 2013. - № 3. - с. 36-38.
АЛГОРИТМ ДИАГНОСТИКИ РЕСПИРАТОРНОГО И АССОЦИАТИВНОГО МИКОПЛАЗМОЗА ПТИЦ
A.П КРАСИКОВ, доктор ветеринарных наук, профессор. Омский государственный аграрный университет имени П. А. Столыпина krasikovl950@mail.ru
И.Г. ТРОФИМОВ, доктор ветеринарных наук, профессор Омский государственный аграрный университет имени П. А. Столыпина
Н.Ф.ХАТЫЮ, кандидат ветеринарных наук, зав. отделом молекулярной биологии Государственного учреждения Омская областная лаборатория.
С.Б.ЛЫСКО, кандидат ветеринарных наук, зав. отделом ветеринарии Сибирского НИИ Птицеводства РАСХН
О.А.СУНЦОВА, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник отдела ветеринарии НИИ Птицеводства РАСХН
РЕЗЮМЕ/SUMMARY. Разработаны, экспериментально обоснованы и предложены ветеринарной практаке экспресс-методы бактериологической и серологической диагностики респираторного микоплазмоза птиц и ассоциированных форм его проявления.
Developed and experimentally substantiated and offered veterinary practice available Express-methods ofbacteriological and serological diagnostics of respiratory mycoplasmosis are considered birds and associated forms of its manifestation
Ключевые слова: микоплазмоз птиц, эпизоотологические, клинические, патологоанатомические, иммунологические, методы диагассгики.
Keywords: mycoplasmosis of birds, epizootologichesky, clinical, pathoanatomical, immunological, diagnostics methods.
Введение. Анализ данных отечественной и зарубежной литературы в отношении различных методик индикации и идентификации возбудителя из первичного материала показывает, что в основном современная диагностика микоплазмоза основывается на иммунологических и бактериологических подходах [1-4]. Полученные первичные изоля-ты на специальных питательных средах для роста микоплазм подвергаются дальнейшим исследованиям с помощью экспресс-методов: реакции непрямой иммунофлуо-ресценции (РНИФ), иммуноферментного анализа (ИФА), с использованием моноклональных антител МАТ или по-ликлональных антител ПАТ; радиоиммунологического анализа (РИА), хемиолюминесцентного анализа (ХЛИА); ДНК-диагностики: ДНК-гибридизации; полимеразной цепной реакции (ПЦР). Последняя является не только более быстрой, но и наиболее точной, выявляя минимальное количество микоплазменной ДНК. Эти методы нашли отражение в работах зарубежных авторов при видовой типизации возбудителей различных инфекционных болезней. По данным отечественной литературы такие исследования проводят большей частью с научной целью и в медицинской практике; массовость диагностических исследований в производственных условиях на базе районных, городских лабораторий ограничена высокой стоимостью исследований и необходимостью специального дорогостоящего оборудования.
Цель исследований. Изучить эпизоотическую обстановку по респираторному микоплазмозу птиц и ассоциативным формам его проявления в Сибирском регионе и усовершенствовать лабораторные методы его диагностики.
Материалы и методы. Для изучения эпизоотической ситуации по респираторному микоплазмозу птиц и его ассоциациям применяли эпизоотологический, клинический, патолоанатомичес-кий, иммунологический, бактериологический и гистологический методы диагностики. Материалом для прижизненного исследования служили пробы: крови и ее сыворотка, спермы, соскобов со слизистой оболочки гортани. Для посмертного - кусочки легкого и стенки воздухоносных мешков, головной мозг, семенники, пораженные паренхиматозные органы. У эмбрионов исследовали хориоа-лантоисную жидкость и желток. Материалом для гистологических исследований служили тимус, фабрициева бурса, селезенка и печень. Посевы из пораженных органов проводили по общепринятым в микробиологии методике на простые (МБА, МПА), элективные (Эндо, ВСА, Клиге-ра и др.) и специальные жидкие и плотные среды для выделения глюкозоферментирующих микоплазм, разработанных нами совместно с Омским НИИ природно-оча-говых инфекций Роспотребнадзора. Морфологию бактериальных клеток изучали в мазках, окрашенных по Граму и Романовскому-Гимза, биохимические свойства культур микроорганизмов - при помощи тест системы ММТ EI. Для иммунологических исследований применяли РНИФ с референтным М. Gallisepticum (НИИЭМ им.Н.Ф. Гамалеи) и полевым штаммами микоплазм и специфическими сыворотками получеными нами путем гипериммунизации ими кроликов по схеме D. Schimmel в нашей модификации (А.П. Красиков, Н.Н. Новикова, 2002), СКРА с цветным стандартным антигеном производства ВНИИЗЖ, ИФА с использование наборов фирмы BioChec (Голландия) с учетом результатов на спектрофотометре ELx800 и компьютерной обработкой данных. Количествоиммунокомпетентных клеток в переферической крови цыплят-бройлеров кросса "Сибиряк" определяли в реакциях розеткообразова-ния с помощью эритроцитарных маркеров (Г.Ф. Коромыс-лов с соавт., 1980). Реакция розеткообразования была адаптирована к работе с клетками крови цыплят. Результаты исследования и обсуждение
Респираторный микоплазмоз зарегистрирован на четырех (33,3%) птицефабриках Омской области, на одной - Новосибирской области (9%) и на 9-ти (47%) Алтайского края. Чаще всего микоплазмоз протекает в ассоциации с эшерихиозом, стафилококкозом, реже с пастереллезом и реовирусным теносиновитом. Причем из всех ассоциаций эшерихиоз встречается наиболее часто. Так, на одной из -исследуемых птицефабрик Омской области микоплазмоз в ассоциации с эшерихиозом выявлен в 72% случаях. Наиболее часто встречаются серотипы кишечной палочки: 01, 03, 020, 078, О103, 0111, 0119. В пределах одного хозяйства выделяли два, реже - три серотипа.
Анализируя результаты бактериологических и серологических исследований, нужно отметить, что, несмотря на отсутствие выраженной клинической картины респираторного микоплазмоза, возбудитель присутствует в ряде птицеводческих хозяйств Омской области и Алтайского края. При этом источником инфекции являются не только куры, но и петухи, выделяя микоплазмы со спермой, способствуя тем самым дальнейшему распространению возбудителя. Установлено, что наиболее чувствительны к заражению респираторным ассоциативным микоплазмозом, с развитием комплекса клинических признаков, цыплята в возрасте 1-50 дней. При этом в структуре гибели молодняка доля инфекционных болезней составляла 67,3%, из них 100% приходилось на микоплазмоз в ассоциации с колибактериозом (эшерихиозом). Переболевший молодняк отставал в росте и развитии. Куры-несушки и петухи, не имеющие видимых клинических признаков болезни, являются скрытыми носителями возбудителя респираторного микоплазмоза и источником инфекции для потомства. Так, по результатам бактериологических исследований, наибольшее количество кур микоплазмоносителей (60%) выявлено в пик яичной продуктивности (220 дней), при этом средний титр антител в ИФА составлял 7387±1253. Количество же петухов микоплазмоносителей увеличивалось с возрастом и к 372 дням достигало 70%, а число реагирующих в ИФА - до 82% со средним титром 5165±137.
Индикация микоплазм у 43% эмбрионов, а также наличие антител у суточных цыплят (64,8%) и выделение от них М. gallisepticum (55%) свидетельствует о передаче инфекции трансовариальным путем, который является основным. Кроме того, значительное количество культур М. gallisepticum было выделено из спермы петухов, что свидетельствует об ее интенсивной обсемененности и заражении ею кур, особенно при их искусственном осеменении полиспермой.
По нашим наблюдениям в спонтанных условиях птица восприимчива к эшерихиозу с суточного, а к респираторному микоплазмозу - с 20-дневного возраста. Распространению респираторного микоплазмоза и эшерихиоза на птицефабриках Омской области способствуют предрасполагающие факторы: нарушение температурного режима, недостаточный воздухообмен, переуплотнение птицы, применение живых вакцин против вирусных инфекций. При этом мясная птица более восприимчива к микоплазмозу, чем птица яичных пород: число положительно реагирующих кур достигает к 300-дневному возрасту 100% и удерживается на этом уровне до конца жизни. Ассоциативные формы течения респираторного микоплазмоза осложняют эпизоотическую ситуацию, затрудняют диагностику, профилактику и меры борьбы с ним.
При экспериментальном воспроизведении ассоциированного течения респираторного микоплазмоза с эшерихиозом у цыплят нами установлено, что инкубационный период составляет 6-18 часов. Клиническое проявление болезни в начальный период характеризуется общим угнетением, отказом от корма, тяжелым дыханием, взъерошенным оперением, скучиванием птицы небольшими группами. В дальнейшем угнетение усиливается, птица не реагирует на раздражитель, у нее наблюдается расстройство пищеварения, дыхания. При спонтанном заражении у цыплят наблюдали сходные, но менее выраженные клинические признаки. В проведенном эксперименте гибель птицы наблюдали через 8 часов после заражения, которая длилась до 8 дней. На 3-4-й день после заражения отмечали одно- или двусторонний ринит, одышку, трахе-альные хрипы, а на 9-й день общее состояние несколько улучшалось, хрипы ослабли. Через 12 дней после заражения состояние птицы было удовлетворительным, хрипы отсутствовали.
Основные патологоанатомические изменения при респираторном микоплазмозе, ассоциированном с эшерихиозом, локализовались в сердце, легких, воздухоносных мешках, печени, селезенке, кишечнике в виде серозного, серозно-фибринозного и фибринозного воспаления. Участие Е. coli в ассоциативном инфекционном процессе проявляется развитием фибринозного воспаления перикарда, капсулы печени, воздухоносных мешков и брюшины.
Методы оценки Т- и В-систем позволили раскрыть механизмы функционирования иммунной системы и выявить нарушения в системе иммунного гомеостаза у инфицированных цыплят. В результате проведенного исследования установлено увеличение абсолютного и относительного количества лейкоцитов и нейтрофилов, особенно в первую неделю после заражения, что является ответной иммунологической реакцией на возбудителей М. gallisepticum и Е. coli. Псевдоэозинофилы, как наиболее подвижные клетки, появляются первыми в месте вторжения чужеродного агента и стимулируют функциональную активность моноцитов, эозинофилов и лимфоцитов, выполняя защитную функцию в ходе воспалительных процессов.
Снижение абсолютного количества лимфоцитов через 14—21 день после заражения указывает на угнетение развития лимфоидной системы, торможение лимфопоэ-за, что негативно сказывается на функции иммунитета и сопровождается снижением абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов у инфицированных цыплят на 14—21-й день. Это подтверждается гистологическими исследованиями: делимфоцизацией лимфоидных фолликул фабрициевой бурсы, уменьшением количества лимфоцитов и исчезновением коркового слоя в дольках тимуса. Инволюция бурсы, в свою очередь, сопряжена с угнетением в ней синтеза иммуноглобулинов. В связи с атрофией центральных органов иммунной системы (тимуса и фабрициевой бурсы), их функции в определенной степени реализуются вторичными лимфоидными органами (селезенкой и печенью), что подтверждается иммунологическими и морфо-функциональными изменениями в этих органах при гистологических исследованиях.
Рост количества В-лимфоцитов (через 7, 14 и 21 день после инфицирования) объясняется усилением иммунологической реакции селезенки, которая проявляется формированием множества лимфоидных фолликулов, состоящих из больших и малых лимфоцитов, молодых плазматических клеток. Это согласуется с утверждениями N.L. Payne (1971) о поглощении антигенов и образовании антител лимфоидными клетками красной и белой пульпы селезенки. Периоды роста В-лимфоцитов совпадают с периодами образования антител к возбудителю М. gallisepticum, что подтверждается данными серологических исследований. Так, через 7 дней после заражения в СКРА выявили 15% положительно реагирующих цыплят, а к 14 и 21-му дням исследования - 100%. С помощью ИФА была прослежена динамика накопления антител. Через 7 дней после инфицирования средний титр по группе составил 89,0±0,9, к 14-му дню - 874,0±16,1 и на 21-й день -1319 ±76,98, при этом оставаясь на уровне, незначительно превышающем диагностический титр (1:800). Нарастание уровня антител у цыплят опытной группы указывает на состояние их инфицированности М. gallisepticum.
При бактериологическом исследовании цыплят опытной группы во всех возрастных периодах были изолированы исходные культуры Е. coli и М. gallisepticum, в контрольной интактной группе патогенной микрофлоры на всем протяжении опыта не обнаружено.
Таким образом, заражение цыплят М. gallisepticum и Е. coli вызывает значительные изменения в Т- и В-систе-мах иммунитета и картине крови. Иммунодефицитное состояние в данном случае - это приобретенный дефект иммунной системы, выражающийся в неспособности организма в полной мере осуществлять реакции клеточного и гуморального иммунитета. Причиной иммунологической недостаточности явилась ранняя инволюция центральных органов иммунной системы (тимуса и бурсы), которая выражается делимфотизацией и кистозным перерождением лимфоидных фолликулов и разрастанием межфолликулярной ткани бурсы, а также исчезновением коркового вещества, перемещением лимфоцитов в мозговую зону, образование кистозных полостей, уменьшением долек тимуса и окружением их жировой тканью.В настоящее время начинают появляться новые разработки специальных питательных сред для выделения микоплазм и уреаплазм. Вместе с тем, до сих пор не созданы универсальные промышленные серийно выпускаемые среды с отработанной технологической основой производства, которые бы обеспечивали рост всех микоплазм, включая и уреаплазмы. Имеющиеся прописи составов питательных сред для диагностики микоплазмозов и уреаплазмоза не являются стандартными, и поэтому могут быть незначительные отличия в процессе их приготовления, зависящие от качества мяса, используемого для приготовления питательной основы. Они требуют автокла-вирования, стерилизации и имеют минимальные сроки хранения.
Предлагаемые нами среды отвечают предъявляемым к ним требованиям. Оригинальный состав ингредиентов представлен основой с унифицированным набором стандартных питательных компонентов и внесенными необходимыми обогащающими добавками, определенным количеством индикатора, оптимальным набором и концентрацией антибиотиков, сывороткой крови, оптимальным значений рН на разных стадиях технологического процесса. Отработанная стандартная технология получения жидких диагностических сред для индикации микоплазм респираторного тракта, включает получение основы с добавлением в нее питательных компонентов и соответствующих субстратов ферментативной активности (глюкоза, аргинин, мочевина), сыворотки и антибиотиков, а также стерилизующую фильтрацию и заключительную пастеризацию. Также технологически обоснован процесс получения сухих основ плотных сред, что дает возможность идентифицировать выделенные культуры по характеру роста колоний. Использование диагностических сред позволяет осуществлять индикацию и групповую дифференциацию микоплазм, а также посредством титрации оценивать степень их накопления в цветообразующих единицах (ЦОЕ) или колонии образующих единицах (КОЕ).
Качественные характеристики предлагаемых нами сред были изучены в соответствующих опытах по определению чувствительности и специфичности жидких, полужидких и плотных питательных сред для индикации аргинин- глюкозоферментирующих микоплазм, уреаплазм.
Анализ результатов проведенных опытов показал, что питательные среды, разработанные нами совместно с НИИПОИ Роспотребнадзора, соответствуют по всем показателям, предъявляемым к ним требованиям. А именно, обладают высокой чувствительностью к микроорганизмам, относящимся к классу Mollicutes; скоростью роста тест-штаммов М. gallisepticum и М. fermentans - в течение трех суток и U. urealyticum - в течение суток; селективной способностью, которая выражается в ингибиции данными питательными средами тест-штаммов Staphylococcus aureus WHO-2, Proteus mirabilis, Escherichia coli 9001, которая не влияет на скорость роста микоплазм и уреаплазм, а присущая им стабильность биологических свойств позволяет сохранять жидкие среды в условиях холодильника до 6-ти месяцев.
Сухие диагностические среды для индикации глюкозо- и аргининферментирующих микоплазм и уреаплазм также отвечают предъявляемым к ним требованиям. Данные среды экономичны, удобны в применении. Их можно использовать в качестве основ для приготовления плотных и полужидких сред, что повышает их диагностическую ценность, сроки хранения и упрощает транспортировку.
Высокая чувствительность сред обеспечивает рост на плотной и полужидкой среде не менее чем 1,0x105 КОЕ. Скорость роста тест-штаммов М. gallisepticum на плотной среде пять - и на полужидкой - трое суток, М. fermentans -пять и четверо суток и U. urealyticum - четверо и трое суток. Селективная способность выражена в ингибиции данными питательными средами роста тест-штаммов Staphylococcus aureus WHO-2, Proteus mirabilis, Escherichia coli 9001 и отсутствие таковой, на микоплазмы и уреаплазмы. Биологические свойства среды в условиях холодильника сохраняются до года. Предлагаемый нами культуральный метод прост в постановке, не требует специального оборудования и позволяет проводить как индикацию, так и дифференциацию возбудителей, определять их титры.
В качестве дополнительного теста для диагностики микоплазмозной инфекции рекомендуем реакцию непрямой иммунофлуоресценции с помощью которой можно проводить индикацию и идентификацию различных видов микоплазм, изучать их антигенные свойства и родство.
Рекомендуемые методы бактериологической и серологической диагностики были изучены в экспериментальных условиях на цыплятах-бройлерах. В результате проведенного опыта было показано, что специальные диагностические питательные среды для индикации микоплазм и уреаплазм активны и чувствительны в отношении данных микроорганизмов, в то же время стабильно ингибируют рост других микробов, находящихся в ассоциации с микоплазмами. Серологическое исследование подтверждает данные бактериологического исследования, а РНИФ является дополнительным высокочувствительным и специфичным методом диагностики микоплазмозной инфекции. При исследовании в РНИФ патологического материала от цыплят со специфическими кроличьими микоплазмозными сыворотками на наличие антигена показана высокая специфичность теста: во всех случаях перекрестных реакций между сопутствующей микрофлорой и микоплазмами не было обнаружено.
Производственное испытание предложенной схемы диагностики ассоциативного микоплазмоза на птице разных половозрастных групп подтверждает данные экспериментальных исследований, а именно: предложенные методы эффективны и информативны в отношении микоплазмозной инфекции. Так, на специальных питательных средах для выделения микоплазм и уреаплазм инги-бируется рост сопутствующей микрофлоры, без отрицательного влияния на рост микоплазм, при этом индикация на жидких средах была параллельно подтверждена результатами роста на плотных средах. У серологического теста (РНИФ) наблюдали высокую чувствительность. С помощью данного метода был выявлен микоплазмозный антиген в сперме петухов, тем самым была определена роль последних в распространении микоплазмоза в родительском стаде. При сравнении бактериологического и серологического методов установлено, что результаты данных исследований, как правило, соответствуют друг другу, что способствует уточнению и повышению достоверности диагностики.
Литература.
1. Гасанова, Т.А. Лабораторная диагностика инфекций, передающихся половым путем при хронических воспалительных заболеваниях репродуктивной системы / T.A. Гасанова // ЖМЭИ. - 2001. - № 3. - С. 60-65.
2. Коромыслов Г.Ф. Методические рекомендации по биохимическим и иммунологическим методам исследования клеток, их компонентов и других биологических субстратов / Г.Ф. Коромыслов, Н.М. Климов, Д.Д. Полоз // ВИЭВ. -ВАСХНИЛ. - М: [б. и.], 1980. - 39с.
3. Payne, N.L. The lymphoid system. - In Physiology and biochemistry of the domestic fowl / N.L. Payne. - London, New-York: Acad. Press, 1971. - № 2. - p. 985-1037.
4. Митрофанов, П.М. Иммунопатология при микоплазмозе животных / П.М. Митрофанов, Х.З. Гаффаров, Р.В. Боровик // Ветеринария. -1984. - № 5. - С. 35-37.
